Όταν χρησιμοποιούμε πεπτίδια, συναντάμε συχνά τους δείκτες καθαρότητας πεπτιδίου και περιεκτικότητας σε πεπτίδια. Πολλοί άνθρωποι μπορεί να αναρωτιούνται γιατί η καθαρότητα των πεπτιδίων τους είναι 95%, αλλά η περιεκτικότητα σε πεπτίδιο είναι μόνο 80%. Αυτό συμβαίνει γιατί πρόκειται για δύο εντελώς διαφορετικές έννοιες.
Καθαρότητα πεπτιδίου: Η καθαρότητα πεπτιδίου αναφέρεται στην ποσότητα του πεπτιδίου στόχου που ανιχνεύεται στα 214 nm (214 nm είναι το μήκος κύματος απορρόφησης της πεπτιδικής αλυσίδας) χρησιμοποιώντας ανάλυση HPLC.
Περιεχόμενο πεπτιδίου: Αυτό αναφέρεται στο ποσοστό των πεπτιδίων σε σχέση με μη-πεπτιδικές ουσίες σε ένα δείγμα.
Η καθαρότητα ενός πεπτιδίου αναφέρεται στο περιεχόμενο του πεπτιδίου στόχου που ανιχνεύεται με HPLC στα 214 nm (214 nm είναι το μήκος κύματος απορρόφησης της πεπτιδικής αλυσίδας). Εκτός από το πεπτίδιο στόχο, η HPLC μπορεί να ανιχνεύσει ακαθαρσίες όπως: διαγραμμένες αλληλουχίες (αλληλουχίες στόχου που λείπουν ένα ή περισσότερα υπολείμματα αμινοξέων), περικομμένες αλληλουχίες (αλληλουχίες που δημιουργούνται κατά την προστασία) και ατελώς αποπροστατευμένες αλληλουχίες (με αποτέλεσμα τη διαδικασία σύνθεσης ή την τελική διαδικασία διάσπασης). Ωστόσο, η HPLC δεν μπορεί να ανιχνεύσει νερό και υπολειμματικά άλατα όπως τριφθοροξικό (TFA) και οξικό. Κατά τη διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης, η πεπτιδική αλληλουχία αποκόπτεται από τη ρητίνη χρησιμοποιώντας TFA, και μια μικρή ποσότητα TFA δημιουργείται επίσης κατά τη διάρκεια του καθαρισμού. Επομένως, το ελεύθερο αμινοτελικό άκρο και άλλες πλευρικές αλυσίδες του πεπτιδίου, όπως τα Arg, Lys και His, μπορούν να δημιουργήσουν μικρές ποσότητες ακαθαρσιών TFA. Ένα άλλο θέμα είναι η υγρασία. Τα πεπτίδια συνήθως αφυδατώνονται χρησιμοποιώντας λυοφιλοποίηση, αλλά ακόμα κι έτσι, το νερό θα υπάρχει σε διάφορους βαθμούς ανάλογα με την ικανότητα ομοιοπολικής δέσμευσης. Επομένως, τα παραδοθέντα πεπτίδια τυπικά περιέχουν άλατα TFA και ίχνη νερού, τα οποία δεν μπορούν να ανιχνευθούν με HPLC, οδηγώντας έτσι σε διαφορές στην περιεκτικότητα σε πεπτίδια και στην καθαρότητα.
