Φωσφορυλιωμένα Πεπτίδια

Φωσφορυλιωμένα Πεπτίδια|Τοποθεσία-Ειδική Φωσφορυλίωση Σερίνης/Θρεονίνης/Τυροσίνης|Σύνθεση Φωσφορυλιωμένων Πεπτιδίων Υψηλής Καθαρότητας|Επιστήμη-Πεπτίδιο

Χρειάζεστε-ειδικά φωσφορυλιωμένα πεπτίδια τοποθεσίας για έλεγχο αντισωμάτων, ανάλυση κινάσης ή αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών; Το Science-Το πεπτίδιο παρέχει επαγγελματική υπηρεσία σύνθεσης φωσφορυλιωμένων πεπτιδίων, υποστηρίζοντας συνδυασμό pSer, pThr, pTyr πολλαπλών- τοποθεσιών, υψηλή καθαρότητα, γρήγορη παράδοση, επιβεβαίωση τοποθεσίας. Καλώς ήρθατε να επικοινωνήσετε μαζί μας.

Η φωσφορυλίωση πρωτεϊνών είναι μια από τις πιο κοινές και σημαντικές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, η οποία ρυθμίζει σχεδόν όλες τις δραστηριότητες της ζωής, όπως ο κυτταρικός κύκλος, η σηματοδότηση και η γονιδιακή έκφραση. Για τη μελέτη συμβάντων φωσφορυλίωσης, απαιτούνται συχνά φωσφορυλιωμένα πεπτίδια υψηλής ποιότητας ως εργαλεία - είτε για τη διαλογή ειδικών αντισωμάτων φωσφο- είτε ως υποστρώματα κινάσης για ανάλυση δραστηριότητας, η καθαρότητα και η ακρίβεια των φωσφορυλιωμένων πεπτιδίων έχουν άμεσο αντίκτυπο στην αξιοπιστία των πειραματικών αποτελεσμάτων. Βασισμένο σε περισσότερα από 20 χρόνια εμπειρίας στη σύνθεση πεπτιδίων, το KPT παρέχει ειδικά προσαρμοσμένα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια για εσάς. Από μια-φωσφορυλίωση τοποθεσίας έως την τροποποίηση συνδυασμού πολλών-τόπων, από χιλιοστόγραμμα ερευνητικής δόσης έως γραμμάρια διαγνωστικών πρώτων υλών, διασφαλίζουμε ότι κάθε φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο έχει ακριβείς θέσεις τροποποίησης, υψηλή απόδοση φωσφορυλίωσης και ικανότητα παρτίδας{10}σε παρτίδα{11}.

Τα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια είναι τροποποιημένα πεπτίδια στα οποία μια φωσφορική ομάδα συνδέεται ομοιοπολικά με συγκεκριμένα υπολείμματα αμινοξέων στην πεπτιδική αλληλουχία. Η φωσφορυλίωση λαμβάνει χώρα συνήθως στις υδροξυλομάδες των υπολειμμάτων σερίνης (Ser), θρεονίνης (Thr) και τυροσίνης (Tyr) για να σχηματίσει φωσφο-σερίνη (pSer), φωσφο-θρεονίνη (pThr) και φωσφο-τυροσίνη (pTyr). Αυτά τα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μίμηση της κατάστασης φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών, για τη μελέτη της επίδρασης της φωσφορυλίωσης στη δομή και τη λειτουργία της πρωτεΐνης ή ως εργαλείο για τη διαλογή για αντισώματα και πρωτεΐνες δέσμευσης που αναγνωρίζουν θέσεις φωσφορυλίωσης.

Ανάλογα με την εφαρμογή, τα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μπορούν να ταξινομηθούν ως:

Ένα-φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο τοποθεσίας:μόνο ένα συγκεκριμένο υπόλειμμα φωσφορυλιώνεται και χρησιμοποιείται για τη μελέτη της λειτουργίας αυτής της θέσης.
Πολυ-φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο:Πολλαπλά υπολείμματα φωσφορυλιώνονται ταυτόχρονα, μιμούμενοι την κατάσταση σύνθετης τροποποίησης της πρωτεΐνης.

1. Τοποθέτηση-ειδική φωσφορυλίωση
Υποστηρίζουμε τη σύνθεση φωσφορυλιωμένων πεπτιδίων με τρία υπολείμματα: σερίνη, θρεονίνη και τυροσίνη. Με τη χρήση εμπορικών μονομερών Fmoc-αμινοξέων (φωσφο-προστατευμένων)-ΟΗ, τα φωσφορυλιωμένα αμινοξέα εισάγονται απευθείας σε συγκεκριμένες θέσεις κατά τη διάρκεια της σύνθεσης στερεάς-φάσης, αποφεύγοντας την αβεβαιότητα της τυχαίας φωσφορυλίωσης μετά τη σύνθεση. Κάθε φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο επιβεβαιώθηκε με φασματομετρία μάζας ότι η φωσφορική ομάδα ήταν συνδεδεμένη στη σωστή θέση. Για αλληλουχίες που περιέχουν πολλαπλές πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης, θα σας βοηθήσουμε να σχεδιάσετε μια στρατηγική προστασίας για να διασφαλίσετε ότι η τροποποίηση θα συμβεί στα υπολείμματα που καθορίζετε.

2. Συνδυαστικές τροποποιήσεις σε πολλούς-ιστοτόπους
Για πολύπλοκα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια που απαιτούν πολλαπλές θέσεις φωσφορυλίωσης, υιοθετούμε μια στρατηγική ορθογώνιας προστασίας για να διασφαλίσουμε ότι η φωσφορυλίωση κάθε θέσης μπορεί να ελεγχθεί ανεξάρτητα. Για παράδειγμα, έχουμε συνθέσει ένα 13-πεπτίδιο που περιέχει και pSer και pTyr για έναν πελάτη και και οι δύο θέσεις φωσφορυλιώθηκαν πλήρως χωρίς διαρροή. Ακόμα κι αν οι θέσεις φωσφορυλίωσης είναι γειτονικές μεταξύ τους ή βρίσκονται σε περιοχές που είναι δύσκολο να συντεθούν, έχουμε ώριμες λύσεις βελτιστοποίησης.

3. Υψηλή καθαρότητα και πλήρης χαρακτηρισμός
Κάθε φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο καθαρίστηκε μέχρι την καθαρότητα στόχο με HPLC και το σωστό μοριακό βάρος επιβεβαιώθηκε με φασματομετρία μάζας (MS). Για πεπτίδια που περιέχουν πολλαπλές θέσεις φωσφορυλίωσης, παρέχουμε δεδομένα δευτερογενούς φασματομετρίας μάζας MS/MS για να επαληθεύσουμε τη θέση κάθε θέσης φωσφορυλίωσης με ιόντα θραύσματος. Παραδίδεται λεπτομερής αναφορά COA που περιλαμβάνει καθαρότητα, μοριακό βάρος, φασματομετρία μάζας, επιβεβαίωση θέσεων φωσφορυλίωσης και συστάσεις αποθήκευσης.

4. Συμβατό με άλλες τροποποιήσεις
Τα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μπορούν να εισαχθούν ταυτόχρονα με άλλες τροποποιήσεις (π.χ. βιοτίνη, φθορίζουσα σήμανση, PEGylation, κ.λπ.). Για παράδειγμα, τα επισημασμένα με βιοτίνη-φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε δοκιμές pull-κάτω για τη σύλληψη φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σύνδεσης. Τα επισημασμένα με φθορισμό φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για παρακολούθηση-της δραστηριότητας κινάσης σε πραγματικό χρόνο. και σταθερά ισότοπα-επισημασμένα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εσωτερικό πρότυπο για ποσοτικοποίηση φασματομετρίας μάζας.

1. Έλεγχος ειδικών αντισωμάτων φωσφο-
Τα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια είναι βασικά εργαλεία για την παρασκευή και τον έλεγχο των ειδικών αντισωμάτων φωσφο-. Με τη χρήση φωσφορυλιωμένων πεπτιδίων μαζί με μη-φωσφορυλιωμένα πεπτίδια ελέγχου σε διαλογή ELISA ή μικροσυστοιχιών, μπορούν να ληφθούν αποτελεσματικά αντισώματα που αναγνωρίζουν μόνο τη φωσφορυλιωμένη μορφή. Έχουμε παράσχει φωσφορυλιωμένα πεπτίδια υψηλής{4}καθαρότητας σε πολλές εταιρείες αντισωμάτων για τα προγράμματα ανάπτυξης αντισωμάτων τους και ορισμένα από τα αντισώματα έχουν γίνει δημοφιλή ερευνητικά εργαλεία.

2. Ανάλυση δραστικότητας κινάσης
Τα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υποστρώματα κινάσης για την ανίχνευση δραστικότητας κινάσης, τη διαλογή αναστολέων κινάσης ή τη μελέτη της ειδικότητας υποστρώματος κινάσης. Για παράδειγμα, οι αλλαγές στη δραστηριότητα της κινάσης μπορούν να ποσοτικοποιηθούν χρησιμοποιώντας φωσφορυλιωμένα πεπτίδια ως πρότυπα σε συνδυασμό με ειδικά φωσφο-αντισώματα ή ραδιοσήμανση. Τα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μας είναι σταθερά από παρτίδα σε παρτίδα και είναι κατάλληλα για έλεγχο υψηλής απόδοσης-.

3. Μελέτες αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών
Πολλές πρωτεΐνες της οδού σηματοδότησης αλληλεπιδρούν αναγνωρίζοντας συγκεκριμένα φωσφορυλιωμένα πεπτιδικά μοτίβα. Χρησιμοποιώντας φωσφορυλιωμένα πεπτίδια ως ανιχνευτές, σε συνδυασμό με τεχνικές pull-down ή SPR, μπορούν να αναγνωριστούν νέες πρωτεΐνες δέσμευσης που εξαρτώνται από τη φωσφορυλίωση-. Έχουμε συνθέσει μια σειρά από pTyr-που περιέχουν φωσφορυλιωμένα πεπτίδια για έναν πελάτη και τα χρησιμοποιήσαμε για να εξετάσουμε την ειδικότητα δέσμευσης των τομέων SH2 τους και εντοπίσαμε με επιτυχία αρκετές νέες αλληλεπιδράσεις.

4. Έρευνα στα μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης
Τα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μπορούν να εισαχθούν στα κύτταρα (π.χ. με μικροέγχυση ή λιποσωμική επιμόλυνση) για να μιμηθούν την ενεργοποίηση συγκεκριμένων μονοπατιών σηματοδότησης και να μελετήσουν τα κατάντη αποτελέσματα. Για παράδειγμα, το pSer-που περιέχει φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μίμηση των λειτουργικών αλλαγών κατά τη σύνδεση της πρωτεΐνης 14-3-3. Μπορούμε να παρέχουμε φωσφορυλιωμένα πεπτίδια με αλληλουχίες πεπτιδίων που διεισδύουν στα κύτταρα για άμεση χρήση σε κυτταρικά πειράματα.

5. Ποσοτικά εσωτερικά πρότυπα φασματομετρίας μάζας
Σταθερά σημασμένα με ισότοπα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εσωτερικά πρότυπα για μελέτες ποσοτικής πρωτεϊνικής φωσφορυλίωσης με φασματομετρία μάζας. Μπορούμε να παρέχουμε φωσφορυλιωμένα πεπτίδια που περιέχουν 13C/15N-επισημασμένα αμινοξέα για απόλυτη ποσοτικοποίηση και να εγγυηθούμε συν-έκλουση με φυσικά πεπτίδια.

6. Ανάπτυξη εμβολίου και διαγνωστικού αντιδραστηρίου
Ορισμένες ασθένειες παράγουν αυτοαντισώματα έναντι συγκεκριμένων φωσφορυλιωμένων πεπτιδίων. Τα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντιγόνα για να ανιχνεύσουν αυτά τα αυτοαντισώματα και να βοηθήσουν στη διάγνωση της νόσου. Έχουμε προμηθεύσει φωσφορυλιωμένα πεπτίδια σε διάφορες διαγνωστικές εταιρείες για χρήση στην ανάπτυξη κιτ, και ορισμένες από αυτές έχουν ήδη λάβει πιστοποιητικά εγγραφής ιατροτεχνολογικών προϊόντων.

1. Επικοινωνία αναγκών
Παρέχετε την πεπτιδική αλληλουχία, τη θέση φωσφορυλίωσης (η οποία Ser/Thr/Tyr πρέπει να φωσφορυλιωθεί), τις απαιτήσεις καθαρότητας και τη δοσολογία. Θα αξιολογήσουμε τη δυσκολία σύνθεσης με βάση τα χαρακτηριστικά της αλληλουχίας και θα προτείνουμε την καταλληλότερη στρατηγική φωσφορυλίωσης (π.χ. μεμονωμένη θέση, πολλαπλές θέσεις, επιλογή αναλόγου κ.λπ.).

2. Συνθετικό σχέδιο
Επιλογή κατάλληλων στρατηγικών προστασίας. Για τα συμβατικά φωσφορυλιωμένα πεπτίδια, χρησιμοποιήσαμε μονομερή που διατίθενται στο εμπόριο όπως Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH, Fmoc-Thr(PO(OBzl)OH){{4}OH και Fmoc-Tyr(PO(OBzl)OH απευθείας κατά τη διάρκεια των οποίων εισήχθησαν στερεά{7}ΟΗ) σύνθεση. Για πολυ-φωσφορυλιωμένα πεπτίδια, οι συνθήκες αντίδρασης θα πρέπει να βελτιστοποιηθούν ώστε να διασφαλίζεται η πλήρης φωσφορυλίωση κάθε θέσης και να αποφεύγονται οι παρενέργειες.

3. Σύνθεση πεπτιδίων
Η πεπτιδική αλυσίδα συναρμολογήθηκε σταδιακά με σύνθεση στερεάς-φάσης. Τα φωσφορυλιωμένα αμινοξέα με προστατευτικές ομάδες συζεύχθηκαν απευθείας στις θέσεις όπου χρειαζόταν φωσφορυλίωση. Οι συνθήκες αντίδρασης (π.χ. χρόνος σύζευξης και θερμοκρασία) ελέγχονταν αυστηρά κατά τη διάρκεια της διαδικασίας σύνθεσης για να αποφευχθεί η αποβολή των φωσφορυλ ομάδων. Για μακρά πεπτίδια ή αδιάλυτα πεπτίδια, χρησιμοποιούμε σύνθεση με τη βοήθεια μικροκυμάτων- ή ειδικούς διαλύτες για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας.

4. Κοπή και αποπροστασία
Τα πεπτίδια κόβονται από τη ρητίνη χρησιμοποιώντας ένα καθαριστικό-που περιέχει κοπτικό διάλυμα, το οποίο αφαιρεί τόσο τις πλευρικές-προστατευτικές ομάδες της αλυσίδας όσο και τις προστατευτικές ομάδες φωσφορικών. Για ευαίσθητα σε οξύ-φωσφορυλιωμένα πεπτίδια, οι συνθήκες κοπής (π.χ. μείωση της συγκέντρωσης TFA, προσθήκη σαρωτών) πρέπει να βελτιστοποιηθούν για να μειωθεί η απώλεια φωσφορικών ομάδων.

5. Κάθαρση
Το ακατέργαστο πεπτίδιο καθαρίστηκε μέχρι την καθαρότητα στόχο με παρασκευαστική HPLC. Για πεπτίδια που περιέχουν πολλαπλές θέσεις φωσφορυλίωσης, προϊόντα με διαφορετικές καταστάσεις φωσφορυλίωσης μπορεί να απαιτούν προσεκτική βελτιστοποίηση της βαθμίδωσης για διαχωρισμό. Χρησιμοποιούμε διαδικτυακή παρακολούθηση MS για να διασφαλίσουμε ότι συλλέγονται τα προϊόντα-στόχοι.

6. Ποιοτικός έλεγχος
Ανάλυση HPLC: επιβεβαιώστε ότι η καθαρότητα πληροί τις απαιτήσεις, παρέχετε χρωματογράφημα.
Φασματομετρία μάζας (MS): Βεβαιωθείτε ότι το μοριακό βάρος είναι σωστό, επιβεβαιώστε ότι η φωσφορυλίωση είναι επιτυχής και παρέχετε ένα φάσμα μάζας.

7. Παράδοση
Παρέχετε λυοφιλοποιημένη σκόνη και λεπτομερή αναφορά COA, συμπεριλαμβανομένου του αριθμού παρτίδας σύνθεσης, της καθαρότητας, του μοριακού βάρους, των φασμάτων μάζας, των συνθηκών αποθήκευσης και των συστάσεων χρήσης. Όλα τα δεδομένα μπορούν να αναζητηθούν για δημοσίευση ή αναφορά.

1. Μεγάλη εμπειρία στη φωσφορυλίωση
Έχουμε συνθέσει με επιτυχία δεκάδες χιλιάδες φωσφορυλιωμένα πεπτίδια, συμπεριλαμβανομένων αναλόγων μεμονωμένης-θέσης, πολλαπλών-τόπων, φυσικών και μη-αναλόγων. Για δύσκολα συνθετικά φωσφορυλιωμένα πεπτίδια (π.χ. περιέχουν πολλαπλές διαδοχικές θέσεις φωσφορυλίωσης, εξαιρετικά υδρόφοβες, επιρρεπείς σε σχηματισμό δευτερογενούς δομής, κ.λπ.), έχουμε ένα ώριμο σχέδιο βελτιστοποίησης και το ποσοστό επιτυχίας είναι πολύ υψηλότερο από τον μέσο όρο της βιομηχανίας.

2. Ευέλικτες κλίμακες παραγωγής
Είμαστε σε θέση να παράγουμε σταθερές ποσότητες που κυμαίνονται από χιλιοστόγραμμα για έρευνα έως γραμμάρια για βιομηχανική χρήση. Για έργα που απαιτούν μακροπρόθεσμη-προμήθεια, μπορούμε να υπογράψουμε συμφωνίες παρτίδας για να διασφαλίσουμε τη συνοχή κατά παρτίδες (μπορούμε να παρέχουμε δεδομένα σύγκρισης HPLC/MS για πολλές παρτίδες). Προμηθεύουμε φωσφορυλιωμένα πεπτίδια σε πολλές φαρμακευτικές εταιρείες εδώ και αρκετά χρόνια για τις πλατφόρμες ελέγχου φαρμάκων τους με βιογραφικό<5%.

3. Γρήγορη παράδοση
Τακτικές παραγγελίες φωσφορυλιωμένων πεπτιδίων (μήκος<20 aa, single site phosphorylation) can be completed within 12-18 business days. Expedited service can be negotiated to 7-10 working days. For urgent projects, we can coordinate resources for priority arrangement.

4. Επαγγελματική τεχνική υποστήριξη
Όλοι οι διαχειριστές έργων μας έχουν υπόβαθρο πεπτιδικής χημείας και μπορούν να σας παρέχουν επιλογή τοποθεσίας φωσφορυλίωσης, συστάσεις αναλογικών και προτάσεις εφαρμογής. Πολλοί πελάτες ανέφεραν ότι οι συμβουλές μας τους βοήθησαν να αποφύγουν πολλές κοινές πειραματικές παγίδες (π.χ. επιλογή ακατάλληλων αναλόγων φωσφορυλίωσης, κακή σχεδίαση τοποθεσίας που οδηγεί σε δυσκολίες σύνθεσης κ.λπ.).

Είτε χρειάζεστε ένα απλό-φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο τοποθεσίας για έλεγχο αντισωμάτων είτε ένα πολύπλοκο πεπτίδιο συνδυασμού πολλών-τόπων για έρευνα μονοπατιών σηματοδότησης, η KPT Biotech είναι πάντα έτοιμη να σας εξυπηρετήσει με τεχνική εξειδίκευση και αυστηρή στάση. Η ομάδα μας θα χαρεί να συζητήσει μαζί σας πριν από την έναρξη του έργου σας για να διασφαλίσει ότι ο σχεδιασμός ταιριάζει απόλυτα στις πειραματικές σας ανάγκες.